提到 lncRNA、circRNA，大家最先想到的研究熱點是什麼？lncRNA 的 cis、trans？還是 circRNA 的 ceRNA？事實上，兩種非編碼 RNA（ncRNA）的另一種共有屬性還未被廣泛發現，那就是「編碼」！

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1。  如何獲得 circRNA 並堅定其存在；

2。  如何進行 circRNA 上下調及設計方法；

3。  解析 circRNA 三大功能機制的特點及研究方法；

4。  盤點 circRNA 研究中常用資料庫。

01

非編碼 RNA「編碼」概況

根據許多標準，非編碼 RNA 不太可能編碼功能蛋白。這些標準包括缺乏長的 ORF，缺乏氨基酸序列保守性和缺乏已知的蛋白質結構域1。由於技術手段受限，長久以來，人們忽視了這些分子編碼的短肽對生命活動的影響。

得益於分子技術的發展，Orera2等分析了六種生物的核糖體譜資料，發現 lncRNA 與核糖體關聯達到 30~82%（編碼為 >92%），預示著 lncRNA 存在較大的編碼潛力；如人 MRI-2（69 個氨基酸）刺激 DNA 雙鏈斷裂連線3；人 lncRNA-HOXB-AS3 可編碼長約 53 位氨基酸的短肽，該短肽而非 lncRNA 可抑制結腸癌的發生4。

環狀 RNA（circRNA），同樣具有編碼短肽的功能。其翻譯特性由 m6A 或者 IRES（招募核糖體功能）驅動。Circ-FBXW7 表達 185aa 的短肽與膠質母細胞瘤表型相關5；circ-SHPRH 表達 146aa 的短肽可起到抑制膠質瘤的發生6；circ-ZNF609 編碼的短肽可控制成肌細胞的增殖7。

一系列的報道預示著，sORFs 是一片藍海有待發掘。那麼，

如何研究 ncRNA 的編碼特性呢？我們以 HOXB-AS3（NCBI 登入號 NR_033201）為例為您詳解 lncRNA-sORF 的預測及實驗設計過程。

02

lncRNA-sORF 預測

1

ORF 預測

大部分 lncRNA 編碼的肽段較短、或者一條長鏈裡面包含多個 ORF，優先選擇 ORF 較長的研究。開啟 orffinder 預測網站，輸入登入號 ID 或者序列，其他引數預設（參考已發現最小的短肽，目前預測短肽的最小值是 24aa），點選「submit」，可看到兩條預測結果：

注意只看「strand」為「+」的結果，因為 RNA 是單鏈的，編碼區不會存在負義鏈上。網站預測到 HOXB-AS3 存在兩個短肽，分別為 53、40 個氨基酸，接下來就是進行實驗驗證。

2

實驗設計

針對預測的短肽是否編碼，常規是構建過表達載體並在 ORF 的 C 端新增標籤 （熒光或者 WB 標籤），並需要將翻譯起始位點 ATG 進行突變，以確認翻譯的起始位點。具體操作如下：

方法一：

針對較長的肽，可採取融合 flag 直接進行 WB，直接將 flag 插入在全長 lncRNA 的 ORF 末端，並設計 ATG 突變作為對照（文章還設計了只構建編碼區作為陽參），隨後進行 WB 實驗即可。

方法二：

針對短肽，若 WB 靈敏度不足以檢測到，那麼採取短肽融合熒光策略較優。方法類似，後續透過熒光的表達即可確認肽是否編碼。

03

circRNA 預測

得益於 circRNADb 資料庫對收錄的 circRNA 進行了較多的註釋，circRNA 可以直接查詢網站統計好的預測資料。以 FBXW7（hsa_circ_0001451）為例，直接在 circrnadb 資料庫查詢 FBXW7 名稱，找到對應的 circRNA（在 circrnadb 的 ID 是 hsa_circ_16502），可以獲得資料庫預測的 IRES（也可以用 IRESfinder 預測）以及 ORF 區（同樣可以用 ORFfinder 預測，但是要將序列成環延伸變為線性再進行預測）：

接下來仿照 lncRNA 的做法，在 ORF 末端加上標籤，進行密碼子 ATG 突變，以及 IRES 缺失構建環狀 RNA 過表達，進行表達驗證：

非編碼 RNA 通常轉錄活性較低，且由於較短的 ORF，同於早前認為 lncRNA 是轉錄垃圾，一些科研人員認為大部分短肽是無功能的翻譯垃圾。然而研究發現：多數人類特異性編碼基因是從獼猴或黑猩猩低表達的非編碼 RNA 進化而來8，這表示在選擇壓力下，ncRNA 編碼的肽可作為物種進化時新肽的重要來源2，至於 ncRNA 表達的肽是否具有更加廣泛的生物學意義，還待更多的科學研究！！！

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【參考文獻】

1。GENCODE： the reference human genome annotation for The ENCODE Project；

2。Long non-coding RNAs as a source of new peptides；

3。A human short open reading frame （sORF）-encoded polypeptide that stimulates DNA end joining；

4。A Peptide Encoded by a Putative lncRNA HOXB-AS3 Suppresses Colon Cancer Growth；

5。Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis；

6。A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis；

7。Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis；

8。Hominoid-Specific De Novo Protein-Coding Genes Originating from Long Non-Coding RNAs。

文章來源：吉凱基因

圖片來源：參考文獻

題圖來源：站酷海洛

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