枸杞（Lycium barbarum），又稱枸杞子、紅耳墜 ，為茄科枸杞屬，是一種

“藥食同源”

的植物性保健食品。現代醫學研究充分表明，枸杞多糖、β-胡蘿蔔素、甜菜鹼、牛磺酸、黃酮是枸杞中重要的有效活性成分，具有較強的生理活性、細胞保護作用和免疫活性作用，對抗腫瘤、保肝、降壓、降血糖、抗衰老具有一定功效。

近年來，關於枸杞的研究主要集中在枸杞的深加工的工藝研究和抗氧化、抗炎和抗衰老等功效研究以及發酵過程中活性物質的變化等動態過程研究。目前，枸杞多糖能有效減輕化學毒素引起的壞死性炎症和氧化應激，作為一種食品補充劑在預防肝臟疾病方面具有很大的應用潛力。

酒精性肝損傷已經成為威脅人類健康和生命的一大疾病，預防和治療酒精性肝損傷的重要機制主要為降低氧化應激、壞死性炎症和核轉錄因子活性從而實現肝臟損傷的保護作用，還涉及各途徑介導的腸道菌群失調，腸屏障功能障礙等。

為使得枸杞的有效成分完全提取利用，除對其中有效成分如枸杞多糖，黃酮等提取加工成功能食品，利用生物技術發，成為一種成本較低且能廣泛應用的深加工方式。透過控制微生物的生長，將枸杞中成分轉化成具有健康益處的飲料。發酵能產生獨特的風味、香氣和質地，也可用於食品品質改良及風味提升。在加工生產中，乳酸菌被廣泛使用，酵母菌MN0110自身能夠產生SOD等具有強抗氧化性的物質，提高自由基的清除能力並緩解脂質氧化。

本研究採用乳桿菌MN1030，乳桿菌MN0727，乳桿菌MN0930和酵母菌MN0110對寧夏枸杞原漿進行液態發酵，透過ADH啟用率和SOD酶活力最佳化各自的發酵工藝。對發酵後的枸杞酵素分別進行對HepG2細胞酒精性損傷模型的保護作用評價。

以期選擇能夠增強枸杞酵素解酒護肝功效的的菌種，為開發保護酒精性肝損傷的功能性食品提供基本依據。

發酵工藝的條件最佳化

接菌量

在一定範圍內，不同的接菌量影響發酵酵素的產酸的速度，在一定範圍的pH下，菌種的生長又能受到pH的影響。此外，接種量的增多能夠縮短髮酵時間或縮短延滯期。如圖1，隨著酵母菌MN0110接菌量的增加，ADH啟用率逐漸增大SOD酶活力緩慢上升後趨於不變，在5%時達到最大。乳桿菌MN0727隨著接菌量的增加，在5%接種量下ADH啟用率達到最大，但SOD酶活力卻相對較小，選則3%作為接菌量。乳桿菌MN1030和乳桿菌MN0930變化趨勢一致，SOD酶活力分別於5%，3%時達到最大。綜合以上，

乳桿菌MN0727、乳桿菌MN0930最優接菌量為3%，酵母菌MN0110、乳桿菌MN103最優接菌量為5%。

圖1接菌量對ADH啟用率和SOD酶活力的影響

發酵溫度

為了探究溫度對不同菌種發酵枸杞酵素產生的影響，設定了不同溫度作為發酵條件。菌種在發酵過程中溫度過低或過高，菌種生長緩慢，ADH啟用率和SOD酶活力降低。因此，選擇了37℃作為乳桿菌MN0727和乳桿菌MN1030的最終發酵溫度，29℃作為酵母菌MN0110的發酵溫度，41℃作為乳桿菌MN0930的最終發酵溫度。

圖2 發酵溫度對ADH啟用率和SOD酶活力的影響

發酵時間

由圖3可知，不同種類的菌種對於ADH啟用率和SOD酶活力的影響各不相同，主要是由於菌種的不同特性決定的。4種菌種除乳桿菌MN1030發酵枸杞酵素在ADH的啟用率呈現先上升後下降的趨勢。隨著發酵時間的延長，SOD酶活均呈現先緩慢升高後下降的趨勢。因此，乳桿菌MN0727枸杞酵素和枸杞酵素的最佳發酵時間為36h，乳桿菌MN1030的最優發酵時間為48h，乳桿菌MN0930的最優發酵時間為24h。

圖3 發酵時間對ADH啟用率和SOD酶活力的影響

HepG2 肝癌細胞上驗證酒精性肝損傷的保護作用

MTT篩選造模濃度和給藥濃度

用HepG2細胞為模型細胞，用酒精為損傷誘導劑，構建HepG2細胞酒精性損傷模型。利用MTT法檢測發現，如圖4所示，隨著濃度的上升，細胞的存活率逐漸下降，在700mmol/L時達到IC50。選取500，600，700mmol/L濃度測定LDH洩露率。當酒精濃度為600mmol/L左右時，細胞存活率在50%左右，超過半數致死率，說明造模的酒精濃度給細胞造成損傷但又不至於造成細胞全部死亡，對應的濃度為建立HepG2細胞酒精性損傷模型的最佳損傷濃度。

未做任何處理的細胞對照組的LDH洩露率為100%，此時，不同的造模濃度的洩露量分別為127。80%，153。21%，152。77%。酶的洩露量在600mmol/L和700 mmol/L相差不多，由於後面繼續新增給藥組，時間增加24h，可能也會給細胞帶來損傷。因此，將HepG2細胞酒精性損傷模型的造模酒精濃度設定為600mmol/L。

圖4 酒精性肝損傷造模條件

給藥濃度

由圖5可知，原漿和4個不同菌種枸杞酵素處理組在400μg/mL濃度以內，HepG2細胞存活率均在90%以上，不顯示毒性作用，且各樣品組的細胞存活率相近，說明試驗所選各樣品濃度均不會影響HepG2細胞的正常生長，因此將400μg/mL作為後續的實驗濃度。

圖5 不同菌種發酵枸杞酵素預處理對HepG2細胞存活率的影響

ADH

由圖6可知，乳桿菌MN1030發酵枸杞酵素，酵母菌MN0110均可顯著提高受損細胞中的ADH活力（p＜0。01）。ADH的酶活性在酒精處理後會由於細胞損傷和酒精代謝而增加。酵素組處理後，HepG2細胞中ADH活性升高，說明增強了酒精的代謝，防止乙醛積聚來迅速緩解乙醇誘導的HepG2細胞損傷。

圖6 不同菌種發酵枸杞酵素預處理對酒精性肝損傷HepG2細胞中ADH活力的影響

對HepG2細胞AST和ALT的分泌量的影響

透過酒精性損傷細胞，AST，和ALT的釋放量能夠反應肝細胞的受損程度。炎症和ROS的產生會導致細胞外的AST和ALT含量產生變化，細胞損傷程度輕，胞內的ALT和部分AST逸出，細胞損傷程度重，線粒體內的AST逸出。酒精的處理可能導致細胞膜和線粒體損傷，AST和ALT被釋放到細胞外。與模型組相比，乳桿菌MN0930發酵處理組和原漿處理組的細胞外AST含量具有一定的下降，但是沒有明顯的差異（P＞0。05）。乳桿菌MN0727、酵母菌MN0110、乳桿菌MN1030組均顯著降低了細胞外的AST的含量（P＜0。05）。與對照組相比，模型組ALT的含量顯著升高。較模型組，不同劑量組可顯著降低受損幹細胞的ALT的分泌量。乳桿菌MN1030與模型組差異顯著（P＜0。01），且與對照組水平相近。說明乳桿菌MN1030酵素組對酒精性肝損傷有較好的干預作用。

圖7 不同菌種發酵枸杞酵素預處理對酒精性肝損傷HepG2細胞中AST和ALT的影響

MDA

MDA 作為生物體脂質過氧化的標誌物，主要是由於炎症因子以及ROS等造成細胞內的氧化機制遭受到破壞，引起細胞膜的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化。如圖8所示，與對照組相比，模型組的MDA生成量顯著升高（P＜0。01），是對照組的2。94倍。不同菌種發酵枸杞酵素單獨作用於細胞，均可顯著降低受損肝細胞內MDA的產生量，卻不能恢復至細胞的最初水平。對照組的MDA產生量在2。30μmol/g prot，作用效果最好的酵母菌MN0110和乳桿菌MN1030能將造模組6。77μmol/g prot分別恢復至2。46和3。81μmol/g prot。MDA的顯著降低說明乳桿菌MN0727和酵母菌MN0110發酵對保護細胞免受脂質過氧化的能力要高於其他處理組。

圖8 不同菌種發酵枸杞酵素預處理對酒精性肝損傷HepG2細胞中MDA的影響

SOD

SOD是細胞內抵抗氧化應激的主要酶系之一，是SOD，CAT，GSH-Px抗氧化酶系中最重要的一種酶。圖9顯示，模型組較對照組的SOD酶活顯著降低（P＜0。01），細胞內的抗氧化機制已經失衡，細胞已處於氧化損傷狀態。酵素處理組較模型組SOD酶活均有不同程度的升高，表明酵素處理組能抵禦酒精誘導的氧化應激損傷，透過過量表達SOD酶來恢復HepG2細胞的氧化應激機制。其中酵母菌MN0110發酵處理組的SOD酶活最高，乳桿菌MN1030、乳桿菌MN0930次之、原漿和乳桿菌MN0727最弱。與對照組差異顯著（P＜0。01），說明酵素處理並不能完全抵禦酒精造成的細胞損傷，但在一定程度上具有保護作用。

圖9不同菌種發酵枸杞酵素預處理對酒精性肝損傷HepG2細胞中SOD抗氧化酶活的影響

結論

發酵主要從菌種的選擇和工藝的最佳化來提高發酵食品的功能特性。

本實驗將乳桿菌MN1030、酵母菌MN0110、乳桿菌MN0727、乳桿菌MN0930接種枸杞原漿進行發酵，透過對發酵的條件（接菌量，時間，溫度）進行最佳化，確定具有潛在護肝功能的枸杞酵素的最優發酵條件。使用最優發酵條件下不同菌種發酵的枸杞酵素作用細胞，能顯著降低造模組的MDA的產生，AST和ALT的分泌量，顯著增加SOD酶活力和ADH的啟用率。結果表明，處理組對損傷細胞均具有保護作用，其中酵母菌MN0110和乳桿菌MN1030的保護作用最為顯著（P＜0。01），未發酵原漿對損傷細胞有保護作用，但是效果不顯著（P＞0。05）。酵母菌MN0110和乳桿菌MN1030發酵的枸杞酵素可從氧化應激、脂質代謝方面對緩解酒精性肝損傷具有一定功效。

宣告：本文來源，馮琳等《不同菌種發酵枸杞酵素對酒精性肝損傷的保護作用》，如有侵權，請聯絡刪除。

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