論文作者來自海南醫學院和溫州醫學院。

Lu， Hongwei et al。 “Hydrogen （氫氣） Alleviates Oste骨關節炎rthritis by Inhibiting Apoptosis and Inflammation via the JNK Signaling Pathway。” Journal of inflammation research vol。 14 1387-1402。 13 Apr。 2021， doi：10。2147/JIR。S297622

氫氣治療關節炎非常有價值，本研究從細胞凋亡和炎症角度開展研究，主要意義是尋找氫氣效應的分子基礎，但更重要的意義在於氫氣對關節炎作用本身，特別是氫氣對人類關節炎效果到底是否存在，這種效果和其他治療藥物的優劣，這才是使用氫氣治療關節炎的根本。不解決這些問題，氫氣作用的分子機制有何意義，氫氣對動物的關節炎研究有何價值。

摘要

骨關節炎是一種非常常見的疾病，會導致關節疼痛、殘疾和社會經濟負擔增加。骨關節炎的發病機制與大量炎症和凋亡細胞因子密切相關。據報道，氫氣具有選擇性抗氧化作用，其中許多作用和JNK途徑相關，如抗凋亡、抗炎和抗氧化特性。氫氣是否透過JNK訊號通路對骨關節炎有保護作用尚不清楚。本研究的目的是瞭解氫是否對軟骨細胞有保護作用，並進一步探討其可能的機制。

軟骨細胞取自人軟骨組織。用TBHP刺激細胞，用氫氣處理。採用Western blot、RT PCR、免疫熒光和TUNEL法評價體外處理效果。建立了小鼠內側半月板（DMM）不穩定模型，並用氫氣處理。採用x射線成像、軟骨細胞番紅O染色、細胞凋亡TUNEL染色和免疫組化方法評價體內治療效果。

我們的研究結果顯示，氫可以抑制tbhp誘導的軟骨細胞中的炎症因子（ADAMTS5和MMP13）和凋亡因子（cleaved caspase-3、細胞色素c和Bax）。氫可以抑制JNK訊號通路的啟用，而氫的作用可以被茴香黴素（JNK啟用劑）消除。體內結果顯示，氫可以下調p-JNK的表達和caspase-3活性片段的表達。

我們發現氫氣可透過抑制JNK訊號通路緩解人軟骨細胞的凋亡和ECM降解。手術誘導的DMM小鼠模型中，氫氣治療可以延緩骨關節炎進展。

介紹

骨關節炎是一種不可逆的關節炎變性狀態，可導致嚴重的不穩定的關節，其病理特徵是關節軟骨退行性，進行性軟骨下硬化症，骨贅的發生，以及滑膜炎症作為最普遍的慢性關節炎型別，其對日常活動的影響在老年人中尤其突出。大量研究已經確定了一系列骨關節炎發展的影響因素，包括

炎症、衰老、肥胖、創傷、關節變形、骨質疏鬆等

。

儘管如此，骨性關節炎的發病機制仍不清楚。

氧化應激和炎症已被證明是

骨關節炎

進展的關鍵危險因素

。

此外，大量骨關節炎因子可引起氧化還原失衡，促進軟骨細胞刺激導致炎症細胞因子的產生。目前臨床治療骨關節炎主要以改善關節功能、緩解疼痛為主。然而，該治療方案並不能緩解骨關節炎的進展。因此，探索新的骨關節炎治療策略是必要的。

氫氣是一種無色無味的氣體。它具有多種生物活性，包括抗炎和抗氧化特性。1975年，Dole等人發現97。5%的氫氣可用於癌症治療。Ohta S發現，2%濃度的氫氣可以改善線粒體疾病，因為它可以迅速擴散到組織和細胞。Ohsawa等觀察到吸入1-4% 氫氣可以透過選擇性減少細胞毒性氧自由基來顯著減輕腦缺血再灌注損傷。

前期研究表明JNK訊號通路可調控炎症和細胞凋亡。當受到TBHP（過氧化叔丁醇）等刺激時，JNK的啟用會導致c-Jun的磷酸化。c-Jun降低了蛋白多糖的合成，增強了基質金屬蛋白酶-13 （MMP-13）的產量。Gao等發現LncRNA MALAT-1可以透過JNK訊號通路抑制細胞凋亡和軟骨基質降解。Jiang等人發現Nesfatin-1抑制il -1β誘導的NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Bax/Bcl-2訊號通路的啟用JNK通路的啟用刺激了Bax、Cytochrome c、cleaved caspase-3等凋亡介質的產生。因此，抑制JNK通路的啟用可能是一種很有前途的治療策略。最近的一項研究表明，氫氣可以透過降低MMP-13和增加II型膠原酶（Col II）的表達來抑制氧化損傷。但目前尚不清楚氫氣是否透過JNK通路介導其在骨關節炎中的保護作用。

在本研究中，我們發現氫氣在骨關節炎中發揮軟骨保護作用，並在體內和體外條件下探索其潛在機制。在這裡，軟骨細胞暴露於過氧化叔丁醇（TBHP）體外誘導氧化應激。我們發現氫氣可能透過JNK通路抑制過氧化叔丁醇誘導的軟骨細胞凋亡和炎症。此外，茴香黴素啟用JNK可消除氫氣的抗凋亡和抗炎作用。因此，氫氣透過JNK訊號通路抑制細胞凋亡和炎症反應，減輕骨關節炎。我們的研究突出了氫氣在骨關節炎中的治療潛力，並探討了氫氣在軟骨細胞中的抗凋亡和抗炎作用機制。

材料和方法

人類骨關節炎的組織採集和實驗得到溫州醫科大學第二附屬倫理委員會（倫理線：LCKY-2019-67）和育英未知兒童醫院的批准，並遵循赫爾辛基宣言的指導原則。本研究的受試者均獲得知情同意。

小鼠骨關節炎模型的建立

本實驗取10周齡C57BL/6雌性小鼠45只，來自中國科學院上海動物中心。腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉後，用顯微外科剪刀剪斷內側半月板的脛骨韌帶建立骨關節炎模型。假手術組小鼠左膝關節也行不處理內側半月板韌帶的關節切開術。術後將小鼠隨機分為三組（n = 15）：假手術組、骨關節炎組（DMM）和骨關節炎組（DMM + 75% 氫氣）。每天吸入氣體1小時。

x射線成像檢測

術後8周對小鼠進行影像學評估。使用x光機確定骨贅的形成、關節間隙和軟骨表面鈣化。

組織病理分析

Safranin-O/Fast Green檢測關節軟骨破壞情況。光鏡下觀察小鼠軟骨細胞及其周圍組織的形態學變化。透過國際骨關節炎研究學會（骨關節炎RSI）的脛骨髁內側和股骨內側平臺評分系統評估關節軟骨的破壞情況。

TUNEL染色

在固定軟骨細胞或軟骨切片後，根據製造商的說明，使用原位細胞死亡檢測試劑盒（Roche， Basel， Switzerland）在黑暗潮溼的房間進行TUNEL染色。接下來，用DAPI染色細胞核。熒光顯微鏡下檢測凋亡細胞DNA鏈斷裂陽性染色。

免疫組織化學分析

首先對膝關節進行4%多聚甲醛（PFA）固定、脫鈣、石蠟包埋，並切成7個µm切片進行脫親和覆水化處理。然後，在37℃下，使用過氧化氫（3% v/v）和胰蛋白酶edta溶液（0。25%）對組織學切片進行30分鐘處理。這些切片在37°C BSA（10%）中孵育60分鐘後，在4°C用抗caspase-3和P-JNK的一抗處理24小時。然後，在第2天使用酶標第二抗體在4°C下切片孵育1 h。在image - pro Plus 6。0版輔助下完成影象分析，定量分析採用每組5個切片。

人軟骨細胞的分離與培養

首先，我們從10例在溫州醫科大學附屬第二醫院接受全膝關節置換術的骨關節炎患者（男女各佔一半，年齡54±8歲）中收集人類軟骨組織，將其切成小塊，用PBS沖洗3次。然後，用膠原酶II在37°C下孵育4 h。800 rpm離心6 min後，將消化後的軟骨組織懸液放入燒瓶中進行組織培養。在37°C，軟骨細胞在5% CO2氣氛下，使用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養基培養。每隔一天更換一次培養基。我們使用胰蛋白酶傳代培養人類細胞，直到達到80 ~ 90%的融合。

氫氣的使用方法

實驗前，氫氣儲存在氣瓶中。然後混合氫氣、氧氣和氮氣，透過三路連線調整氫氣濃度

(6.25、12.5、25、50、75% (vol/vol)

），用TRACE GC Ultra氣相色譜法測定。每組中除去一定體積的氫氣後，將剩餘體積按空氣中氮氣和氧氣的比例混合，即0。78：0。21。用TBHP預處理軟骨細胞24 h，並將氫氣匯入培養細胞4 h。

CCK-8

按照製造商的說明，使用CCK-8試劑盒檢測氫氣對軟骨細胞的細胞毒性。首先，將細胞以每cm2 50000個細胞的密度鍍於96孔板中24小時，並與不同濃度的氫氣（0、12。5、25、50和75%）孵育4小時。然後，在PBS中沖洗3次。最後，每孔加入10 mol/L CCK-8溶液2 h，在450 nm波長下用分光光度計觀察光密度。

統計分析

實驗至少進行了三次。所得資料用平均值±SEM表示。資料透過GraphPad Prism（美國）進行分析。組間比較採用單因素方差分析，然後採用Tukey檢驗。P < 0。05的機率值認為有統計學意義。

結果

圖1

氫氣抑制小鼠DMM模型中骨關節炎的進展。這個結果最重要，三種比較，第一是正常情況，二是關節炎，有一些軟骨消失，表現為紅色變淡，氫氣治療後恢復正常。

圖2

氫氣抑制骨關節炎小鼠軟骨細胞凋亡。

圖3

氫氣對人軟骨細胞活力的影響。

氫氣在tbhp誘導的人軟骨細胞中發揮抗凋亡作用

圖4

氫氣對tbhp誘導的人軟骨細胞凋亡的影響。

圖5

氫氣對tbhp誘導的人軟骨細胞中細胞因子和凋亡相關蛋白表達的影響

氫氣在tbhp誘導的人類軟骨細胞中發揮抗炎作用

圖6

氫氣對tbhp誘導軟骨細胞ECM合成的影響。

討論

骨關節炎是一種以長期疼痛和關節受限為特徵的慢性關節退化疾病目前治療骨關節炎的選擇是早期應用非甾體抗炎藥物（NSAIDs），但它們僅能緩解臨床症狀。此外，它們還會導致一系列副作用，如心臟病發作和中風人工關節置換術仍然是骨關節炎晚期治療的唯一選擇。因此，一種能夠阻止骨關節炎進展且副作用少的藥物是骨關節炎的潛在治療策略。最近，越來越多的關注集中在抗凋亡化合物，可能能夠治療骨關節炎而沒有有害的副作用生化和生物力學事件誘導軟骨細胞中ECM的凋亡和分解代謝和合成代謝之間的失衡在細胞和動物模型中，一些基因調控細胞凋亡的藥物治療已經顯示了對骨關節炎發展的治療作用因此，研究軟骨細胞凋亡的潛在機制可能是治療骨關節炎的一種潛在途徑。

氧化應激是軟骨細胞凋亡的主要過程。當TBHP刺激軟骨細胞時，它們產生ROS，如超氧陰離子（O2−）、氫氣O2和羥基自由基（OH）；這導致線粒體損傷並最終導致細胞凋亡越來越多的研究發現過量的ROS會導致軟骨的降解和軟骨細胞的凋亡。因此，降低ROS的產生可能是治療骨關節炎的有效策略。有趣的是，氫是一種抗氧化化合物。

氫是自然界中最輕的元素，是最簡單和最豐富的元素許多研究報道了氫氣在幾種疾病中的抗炎、抗凋亡和抗氧化作用。他們證明吸入4% 氫氣是一種安全有效的治療人類疾病的方法。氫氣因其製備簡單、安全性高、滲透性強、便於攜帶而引起了研究人員的注意。16Peng Guan等發現氫氣透過JNK訊號通路改善了慢性間歇性缺氧（CIH）誘導的腎損傷Zhao等發現氫氣透過阻斷c-Jun n -末端激酶（JNK）-MAPK。36，減輕內質網應激和心肌細胞凋亡Wu等發現，氫氣透過抑制新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的凋亡和炎症反應而減輕腦損傷37Chen等發現吸入氫可以改善小鼠脊髓損傷後脊髓神經元的凋亡和氧化應激JNK通路是經典的促凋亡通路，已被證明在骨關節炎發展過程中調節軟骨細胞凋亡中發揮關鍵作用。既往研究表明，尿石素A、人參皂苷、木犀草素等藥物透過抑制JNK訊號通路的啟用來保護軟骨細胞。因此，靶向下調JNK磷酸化可能被認為可以有效治療骨關節炎。

因此，

在本研究中，我們透過JNK訊號通路探索

氫氣

對人軟骨細胞的抗凋亡能力。在tbhp處理的人類軟骨細胞中，

氫氣

明顯抑制JNK的磷酸化。由於JNK通路的活性被抑制，Bax和cleaved caspase-3等凋亡因子的產生被下調，從而改善了

骨關節炎

的進展。

總的來說，我們的資料表明氫氣在骨關節炎發展過程中具有抗凋亡活性，這在thbp處理的軟骨細胞上得到了證實，JNK通路可能參與了其作用機制。因此，氫氣的

作用

是明顯的。此外，與假手術組相比，DMM組關節間隙縮小，ECM降解，軟骨嚴重受損，蛋白多糖嚴重缺乏。經氫氣治療後，上述症狀均得到改善，小鼠DMM模型骨關節炎RSI評分降低。軟骨的TUNEL染色和cleaved caspase-3的IHC染色顯示，氫氣可以緩解軟骨的凋亡。此外，氫氣參與JNKs訊號通路，改善了骨關節炎進展。綜上所述，這些結果和前期研究結果表明，透過抑制JNK通路的啟用，氫氣對骨關節炎的發展有改善作用（圖8）。

圖8

示意圖揭示了氫氣透過JNK通路的參與以及在骨關節炎進展中的潛在保護作用。

有趣的是，人們研究了氫在不同濃度下對各種疾病的治療效果。本研究採用高氫氣濃度（6。23-75%）研究氫氣對骨關節炎的保護作用。然而，由於本研究存在一定的侷限性，氫氣在骨關節炎中的作用仍需進一步研究。例如，

我們不知道高濃度的氫氣是否對身體的其他系統有不良影響。此外，長期低濃度氫對骨關節炎的影響尚未研究；這些有待於今後進一步研究。

綜上所述，我們發現氫氣透過使JNKs訊號通路失活來減輕人軟骨細胞的凋亡反應和ECM降解。同時，在手術誘導的DMM小鼠模型中，氫氣治療對骨關節炎的發展也有重要作用。我們的資料表明氫氣具有抗骨關節炎保護活性。

資助宣告

本研究由浙江省自然科學基金專案（LY16H060010）資助。

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